二军医大学学报 2000 Oct；21(10)
　　　　　　　　　　　　　人参皂甙Rg1,Re对淀粉样蛋白诱导原代培养海马及皮质神经元损伤的保护作用

张晓冬,李万亥,枉 前,黄 矛,周丽华,谈冶雄

摘　要
目　的：研究人参皂甙Rg1，Re对β-淀粉样蛋白(β-AP)诱导原代培养海马及皮质神经元损伤的影响。
方　法：测定神经元细胞培养上清中的乳酸脱氢酶(LDH)释放度来检测细胞的受损程度。
结　果：经终浓度为0.4μmol/L的β-AP诱导损伤12h，神经元细胞培养上清中的LDH释放度明显升高；人参皂甙Rg1，Re在10,20μmol/L浓度时均能使LDH的释放度显著减少。
结　论：两种人参皂甙在一定剂量范围内能对抗β-AP诱导的神经元损伤，表现出对神经元一定程度的保护作用。
关键词　人参皂甙Rg1；人参皂甙Re;海马神经元；皮质神经元；神经元损伤
　　 阿尔茨海默病(Alzheimer′sdisease，AD)，即早老性痴呆是一种以记忆减退、认知障碍、人格改变为特征的脑退行性疾病。随着人口的老龄化发展,发病率呈大幅度上升,我国每年增加数十万新患者。而在美国，AD已成为继心脏病、肿瘤和脑中风之后的第四位死亡原因。关于它的病因尚不清楚。自80年代以来，形成了多种学说,如中枢神经递质失调、蛋白质代谢失常、钙自体平衡失调等。通过近年来的研究发现,环境或基因突变导致淀粉样蛋白前体蛋白(amyloidprecursorprotein,APP)代谢异常,在神经元细胞外产生β-淀粉样蛋白(β-amyloidprotein,β-AP)沉积,形成老年斑的中心，并造成神经元损伤，而大量老年斑的出现又是AD的重要神经病理学特征。因此对β-AP的研究已成为AD研究的热点。

　　人参促智和延缓衰老作用的研究一直是受重视的课题。大量的实验资料证明，人参皂甙Rg1，Re是人参促智、抗衰老作用的主要有效成分[2],含人参的复方制剂已用于治疗老年性痴呆[3]。为进一步探讨人参抗衰老的作用机制,用原代培养大鼠海马及皮质神经元建立了β-AP诱导神经元损伤的模型,研究了不同剂量人参皂甙Rg1,Re对其损伤的保护作用。

1　材料和方法

　　1.1　动物　新生SD大鼠,出生24h以内,第二军医大学实验动物中心提供。

　　1.2　药品及试剂　β-AP(Sigma公司);胰蛋白酶、DMEM培养基和马血清(Gibco公司);乳酸锂(上海化学试剂总厂)；辅酶 (上海浦江应用生物化学研究所进口分装)；甘氨酸(中国科学院东方仪器设备公司生化部);TritonX-100(上海化学试剂采购厂分装);人参皂甙Rg1(纯度≥95%,广州市医工所提供);人参皂甙Re(纯度≥95%,沈阳药科大学天然药化教研室提供);阿糖胞苷(上海华联制药厂)。

　　1.3　新生SD大鼠皮质及海马神经元细胞的原代培养[4]　取新生1d的SD大鼠,在无菌条件下取出脑部,去除小脑,分离皮质及海马部分,分别剪碎成小块,加0.125%的胰酶37℃消化30min,终止消化后吹打成细胞悬液,600r/min离心5min。弃去上清,沉淀用培养液吹打成细胞悬液,用300目尼龙网过滤,调整细胞密度至约1.0×106个/ml,以0.5ml/孔接种于预先涂有多聚赖氨酸的24孔塑料培养板中,置于5%CO2,37℃培养箱中培养。第2天全换液,第4天加入阿糖胞苷终质量浓度2.5ml/L以抑制胶质细胞生长,次日全换液。每周换液两次,每次换液一半,接种7～8d后用于实验。

　　1.4　β-AP对神经元的影响　将β-AP溶于DMEM培养基中,置于37℃恒温箱内孵育4～7d,进行老化处理。然后稀释加入培养7～8d的细胞中,使终浓度为特定的浓度梯度并置培养箱中培养一定时间后观察测值。不加入β-AP的正常细胞为空白对照组(Blank)。

　　1.5　不同剂量皂甙对β-AP诱导神经元损伤的影响　取培养7～8d的细胞,每孔加入不同浓度皂甙,使终浓度为特定的浓度梯度并置培养箱中培养3d。取出后加入含β-AP的DMEM溶液,使β-AP终浓度为0.4μmol/L,继续培养12h后测值。

　　1.6　神经元培养上清中乳酸脱氢酶(LDH)的测定　将2ml0.1mol/LpH10.0甘氨酸缓冲液加入到石英比色杯中,加入0.15ml0.5mol/L乳酸锂溶液和0.15ml0.02mol/L辅酶 溶液,加入待测上清200μl,混匀后用分光光度计每隔1min于340nm处读取D值,求取每分钟△D值。待测上清测量完毕后,每孔加入TritonX-1001μl,混合均匀,静置约30min,待细胞膜完全破裂后,按上法再测总LDH活性值,以培养细胞释放的LDH和总LDH的活力的百分比表示LDH的释放度(LDH%)。

　　1.7　统计学处理　实验结果用x±s表示,显著性测定采用t检验。

　　2　结　果

　　2.1β-AP对海马和皮质神经元LDH释放度的影响加入β-AP0.4μmol/L12h后皮质神经元LDH释放显著增加,并随时间的延长和浓度的增加而增加(见表1)。

表1　β-AP对海马和皮质神经元LDH释放度的影响
(n=3,x±s,%)

*P<0.05,**　P<0.01　vs　blank

　　2.2　人参皂甙Rg1和Re对海马和皮质神经元LDH释放度的影响　实验中用β-AP0.4μmol/L培养12h作为诱导损伤的模型(control组)。结果(表2)显示,人参皂甙Rg1在浓度为5,10,20μmol/L时能使海马神经元的LDH释放度减小,在10,20μmol/L时可使皮质神经元的LDH释放度减小。而Re在浓度为5,10,20μmol/L时,可使海马和皮质神经元的LDH释放度降低。

表2　人参皂甙Rg1和Re对海马和皮质神经元LDH释放度的影响
(n=3,x±s,%)

*P<0.05，**P<0.01　vs　control；△△P<0.01　vs　blank

3　讨　论
　　LDH释放与细胞膜完整性相关,神经元受损伤时,胞内LDH释放,且释放量与细胞受损程度呈正相关。因此,实验把细胞外LDH活性与用表面活性剂完全破坏细胞膜后总的LDH活性之比值,即LDH释放度作为评价神经元受损程度的指标。目前的研究表明,AD所表现的在体神经元的变化与损伤存在多种原因,而β-AP沉积的出现可能是最主要和直接的原因[5]。β-AP是一个由39～43个氨基酸组成的多肽,其可溶型正常少量存在于人的脑脊液和血浆中,且无神经毒性。若β-AP转化为不溶型而沉淀,则可侵犯脑内某些与智力有关的特定结构,如海马和一些皮质区域等,出现大量的神经元纤维类淀粉变性,出现老年斑和颗粒空泡变性为主体的病理改变,甚至可能导致神经元缺失[6,7]。因此,保护神经元免受β-AP的神经毒性可能是防治AD的有效手段之一。β-AP的神经毒性涉及到复杂的分子机制[8],主要包括促进自由基的形成,破坏细胞内的钙稳态,导致胞内钙离子超载,降低钾通道的功能,增强细胞因子引起的炎性反应等。文献报道[9]人参皂甙单体对神经元细胞的多种损伤,如谷氨酸毒性、缺血、缺氧有保护作用,人参皂甙Rg1能通过抑制大鼠神经组织内cAMP依赖的磷酸二酯酶增加,抑制神经元细胞内钙离子通道,降低突触体内钙离子浓度,抑制钙自体平衡失调。实验显示人参皂甙Rg1,Re对β-AP诱导的神经元损伤具有保护作用,其作用机制是否与上述作用有关,进一步研究和相关机制的探讨尚待进行。

参考文献
1.RosenbergRN．A causal role for amyloid in A lzhemer’s disease.the end of beginning [J]．Neurology，1993,43(5):851-856.
2.刘文心．人参皂甙Rg1抗衰老和促智作用及其机制研究[J]．生理科学进展，1996，27(2):139-142.
3.马治中，王晓民．.中医药治疗老年性痴呆的研究进展．见：盛树力主编．老年性痴呆：从分子生物学到临床诊治[M]．北京：科学技术文献出版社，1998．126-138．
4.谈冶雄，李万亥，陶学斌．一种缺氧条件下的神经元培养方法[J]．第二军医大学学报，1997，18(2):181-183.
5.Multhaup G，Masters CL，Beyreutherk．A molecular approach to Alzheimer’s disease[J]．Biol Chem Hoppe Seyler，1993，374(1):1-8.
6.Yankner BA，Duffy LK，Kirschner DA．Neurotrophic and neurotoxic effect ofamyloid β protein：reversal by tachykin inneuropeptides[J]．Science，1990，250(4978)：279-282．
7.王琦，谢瑶，姚志彬．β-淀粉样蛋白31～35对体外培养的隔区胆碱能神经元的作用[J]．ChinJNeurosci，1999，15(2)：115-119．
8. Ashall F，Goate AM．Roleof　the　β-amyloid　precursor　protein　in　Alzheimer's　disease[J]．Trends　Biochem　Sci，1994，19(1)：42-46．
9. 刘文心，张均田．人参皂甙Rb1和Rg1对原代培养大鼠海马神经细胞的保护作用．药学学报，1995，30(9)：674-678．